基于网络药理学研究吴茱萸治疗结直肠癌作用机制

天津市人民医院 王娟

中医药常作为结直肠癌手术、放化疗 外的补充和替代治疗，疗法注重扶正祛邪和阴阳 平衡 [1-2]。中药治疗结直肠癌的临床应用广泛，可 缓解临床症状，改善患者生存质量，延长生存期， 降低术后复发转移，缓解化疗副反应，逆转药物 耐药等。吴茱萸为芸香科植物，多项研究证实吴 茱萸及其活性成分具有抗肿瘤作用。吴茱萸碱对 多种肿瘤细胞 , 如宫颈癌 [3]、卵巢癌 [4]、胃癌 [5-6]、 胰腺癌 [7]、肝癌 [8]、胶质瘤 [9] 等具有肿瘤抑制作 用。小檗碱通过 JAK1-STAT3 信号通路抑制膀胱癌细胞增殖 [10]。槲皮素在乳腺癌 [11]、前列腺癌 [12]、 肺癌 [13]、食管癌 [14] 等多种肿瘤中发挥抑制癌细 胞增殖侵袭，促进凋亡作用。吴茱萸的抗肿瘤作 用机制尚未阐明，仍需进一步研究。本文运用网 络药理学研究及生物信息学分析，构建吴茱萸 - 靶 点 - 结直肠癌的中药调控网络，揭示吴茱萸作用于 结直肠癌的活性成分，作用靶点及信号通路，研 究吴茱萸抗结直肠癌机制，为临床药物应用提供 理论基础。

1　材料与方法 1.1　吴茱萸活性成分筛选及活性成分靶点获 取　基于中药系统药理学数据库（TCMSP）数据 库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[15]，检索 吴茱萸的活性成分；设定口服利用度 (OB）≥ 30% 和类药性（DL）≥ 0.18 进行筛选。进一步应用 TCMSP 数据库筛选吴茱萸活性成分的作用靶点， 基于 UniProt 数据库（http://www.uniprot.org/）[16] 对作用靶点进行校正注释，整理并去重后得到活 性成分对应靶点。

1.2　吴茱萸抗结直肠癌潜在靶点预测　通过 GeneCards 数据库（https://www.genecards. org/）[17] 获得结直肠癌相关疾病靶点。对结直肠癌相关疾 病靶点与吴茱萸主要活性成分作用靶点取交集， 应用 R 语言（R 3.6.3，软件包 ggplot2）绘制韦恩图。

1.3　构建吴茱萸抗结直肠癌蛋白互作网络　将筛 选得到的结直肠癌相关疾病靶点与吴茱萸主要活 性成分潜在作用靶点的交集靶点导入 STRING 数 据库（https://string-db.org）[18]，物种设定为“Homo sapiens”，置信度设置为 0.9，对作用靶点进行蛋 白互作分析。使用 Cytoscape 3.8.0 软件进行 PPI 网络绘制，使用 Cytoscape 3.8.0 软件网络拓扑分 析插件 cytoNCA 分析各网络节点的度值 (degree)、 介度中心性 (betweenness centrality，BC)、接近中 心性 (closeness centrality，CC) 指标。

 1.4　吴茱萸抗结直肠癌靶点生物功能分析及 通路分析　差异靶点富集分析，包括基因本体 （gene ontology，GO） 富 集 和 信 号 通 路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 富 集。GO 富集分析可以了解差异基因的分子功 能（molecular function，MF）、 参 与 的 生 物 过 程 (biological process，BP) 及细胞中的定位（cellular component，CC）。 应 用 R 语 言（R3.6.3，软件 包 clusterProfiler）[19] 对预测靶点进行 GO 分析和 KEGG 信号通路富集分析，应用 R 语言（R 3.6.3，软件包 ggplot2）进行可视化绘图。

 2　结果

2.1　吴茱萸活性成分筛选以及靶点的筛选　通 过 TCMSP 数据库检索吴茱萸的活性成分，设定 OB ≥ 30% 和 DL ≥ 0.18 筛选，获得化合物 30 个， 包括吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱、吴 茱萸酰胺、棉花皮素、番石榴苷、小檗碱、槲皮 素、异鼠李亭、谷甾醇、β- 谷甾醇等。进一步应 用 TCMSP 数据库获得活性成分对应的作用靶点， 整理去重后得到活性成分对应靶点 198 个。

2.2　 吴 茱 萸 抗 结 直 肠 癌 靶 点 的 筛 选　 通 过 GeneCards 数据库获得结直肠癌相关的靶点 8599 个。对结直肠癌相关疾病靶点与吴茱萸活性成分作 用靶点取交集获得吴茱萸治疗结直肠癌潜在靶点 162 个，应用 R 语言（R 3.6.3，软件包 ggplot2） 绘制韦恩图

2.3　蛋白互作网络分析　研究吴茱萸治疗结直肠 癌潜在作用靶点的功能和作用机制，将筛选得到的 共有靶点导入 STRING 数据库，物种设定为“Homo sapiens”，置信度设置为 0.9，对作用靶点进行蛋 白互作分析。使用 Cytoscape 3.8.0 软件进行 PPI 网络绘图（图 2A），使用 Cytoscape 3.8.0 软件网 络拓扑分析插件 cytoNCA 分析各网络节点的度 值 (degree)、介度中心性 (betweenness centrality， BC)、接近中心性 (closeness centrality，CC) 指标 （表 1），取度值前 10 个靶点为核心靶点（图 2B）， 包括 AKT1、TP53、MAPK1、JUN、HSP90AA1、 RELA、TNF、EGFR、ESR1、MYC

2.4 GO分析和KEGG分析　应用R语言（R 3.6.3， 软件包 clusterProfiler）对预测靶点进行 GO 分析， 在满足 padj<0.1 & qvalue<0.2 条 件 下，BP 共 有2471 条，CC 共有 90 条，MF 共有 195 条；在满足padj<0.05 & qvalue<0.2 条件下，BP 共有 2233 条，CC 共有 73 条，MF 共有 171 条。选取 P 值最小的前 4 名条目建立气泡图（图 3A）和网络图（图3B）。分子功能分析（MF）得到结果包括泛素蛋白连接酶结合，调节类固醇受体活性，调节转录因子活性，调节核受体活性等。富集度较高的生物学过程 (BP) 主要涉及细胞对脂多糖的反应，细胞对氧水平的应答，对细菌来源分子的反应，缺氧反应等。应用 R 语言（R 3.6.3，软件包 clusterProfiler） 对预测靶点进行 KEGG 分析，在满足 padj<0.1 & q value<0.2 条件下，KEGG 共有 173 条；在满足 padj<0.05 & qvalue<0.2 条 件 下，KEGG 共 有 161 条。依 P 值倒序排列，排名前面的肿瘤相关 信号通路条目建立气泡图（图 4A）和网络图（图 4B）。排名靠前的信号通路包括 PI3K-Akt 信号通 路，AGE-RAGE 信号通路，MAPK 信号通路，癌 症中的蛋白多糖，细胞衰老，TNF 信号通路，松 弛素信号通路，细胞凋亡，HIF-1 信号通路，雌激 素信号通路，铂类耐药，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 抵抗，P53 信号通路等。

3　讨论 中医认为恶性肿瘤是由于身体内部阴阳失衡 所引起，环境、禀赋、七情、饮食起居等原因导 致体内“正气”亏虚，“邪气”聚集，发生癌变。 结直肠癌的发生、发展及转归过程是正邪相争的结果。当“邪气”强盛于“正气”，疾病进展，患 者即出现临床症状。中药抑制肿瘤进展的作用包 括：抑制肿瘤细胞增殖侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡， 提高和恢复机体免疫功能，增强化疗药物疗效， 逆转细胞株耐药等。Lai 等 [20] 研究发现，龙葵提取物可通过降低 MCF-7 抑制肿瘤细胞增殖，并上 调 Caspase-3 诱导乳腺癌细胞凋亡。三叶草提取物 抑制肺癌细胞 A549 侵袭转移是通过下调 MMP-2、 MMP-9 表达及上调 TIMP-2 表达 [21]。消癌平注射 液通过降低乳腺癌细胞中 ATF-3 的表达，促进肿 瘤细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭 [22]。梁颖等 [23] 研究了益脾活血方促进肝癌术后免疫功能的恢复， 通过降低 B7-H1 表达，消减对 T 淋巴细胞活化的 抑制，纠正负性免疫调节。小檗碱与顺铂联合应 用逆转胃癌的多药耐药，其机制是通过下调 P-gp、 MRP 蛋白表达，并上调 caspase 家族蛋白表达，诱 导癌细胞凋亡 [24]。

本文对吴茱萸的抗结直肠癌作用机制进行探 讨。应用网络药理学方法筛选出吴茱萸活性成分 30 个，包括生物碱类，如吴茱萸碱、吴茱萸次 碱、吴茱萸卡品碱、小檗碱等；以及黄酮类，如槲 皮素、异鼠李亭、棉花皮素等。这些活性成分涉 及 198 个靶点，其中 162 个与结直肠癌相关，证 实了吴茱萸具有抗结直肠癌作用。这种多活性成 分，多靶点中药涉及的作用机制复杂，既往研究 多为单一靶点、通路研究证实吴茱萸的抗结直肠 癌作用。吴茱萸碱抑制人结肠细胞的增殖迁移。 石雪萍等 [25] 认为机制是通过下调 HDAC3 来影 响 NF-κB 及 p53 蛋白的表达抑制增殖和迁移。李 海星等 [26] 则认为是通过抑制 SIRT1 的表达，激 活 NF-кB 信号通路，进而抑制 MMP-9 抑制结肠 癌细胞增殖和迁移。陈海青等 [27] 应用脂多糖处理 人结肠癌上皮细胞制备炎症损伤模型，吴茱萸碱 能逆转此炎症损伤，上调紧密连接蛋白表达，维 持肠上皮屏障完整性。常金荣等 [28] 研究了对细胞 周期的影响，认为盐酸小檗碱和吴茱萸碱通过靶 向 miRNA-17-92 抑制 E2F1 蛋白表达，阻滞细胞 分裂分化，进而抑制癌细胞增殖。体内实验显示， 吴茱萸碱对炎症相关性结直肠癌具有良好的预防 作用，其作用机制可能为降低组织炎症水平以及 抑制癌细胞异常增殖 [29]。方剂左金丸和反左金丸 皆由黄连和吴茱萸组成，主要成分为吴茱萸碱和 小檗碱，通过抑制癌细胞激活及生长，诱导细胞 凋亡起到抗肿瘤作用 [30-31]。致癌剂 1, 2- 二甲基 酰肼 (DMH) 诱导大鼠大肠癌实验模型中，左金丸 有效阻碍早期大肠癌的发生和发展 [32]。钱平等 [33] 阐述了左金方的抗胃肠肿瘤作用及吸收、代谢和 药物代谢动力学等体内过程的研究进展。连黛胶 囊是在左金丸方中加了青黛，中药物配伍关系为：小檗碱为君，青黛为臣，吴茱萸碱为佐使。连黛 胶囊临床治疗胃癌、大肠癌有显著疗效，其可能 机制为抑制 ras 基因的激活和阻止野生型 p53 基因 突变从而抑制胃肠肿瘤进展 [34]。杨传标等 [35] 研 究探讨了连黛胶囊治疗胃肠肿瘤与中医证型的关 系，发现临床应用中对热毒 ( 湿热 ) 证疗效最优。 吴茱萸及其活性成分吴茱萸碱、小檗碱等目前临 床主要应用于调节胃肠道功能，保护肠道屏障， 减少肠道有害菌群数量等，其抗肿瘤作用还聚焦 于细胞学研究和动物实验，临床应用并不广泛。 既往研究说明吴茱萸治疗肿瘤不是依赖于单一的 靶点及信号通路，各环节研究未能完整统一。因此， 吴茱萸抗结直肠癌的药物开发及临床试验的开展 需要更详细深入的机制研究。课题组利用网络药 理学分析及生物信息学分析预测吴茱萸对结直肠 癌起作用的潜在靶点及信号通路，发现吴茱萸抗 结直肠癌核心靶点包括 AKT1、TP53、MAPK1、 JUN、HSP90AA1、RELA、TNF、EGFR、ESR1、 MYC 等。主要涉及通路包括 PI3K-Akt 信号通路， AGE-RAGE 信号通路，MAPK 信号通路，癌症中 的蛋白多糖，细胞衰老，TNF 信号通路，松弛素 信号通路，细胞凋亡，HIF-1 信号通路，雌激素信 号通路，铂类耐药，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗， P53 信号通路等。这些核心靶点及关键通路的研究 有待于后续实验进一步验证。

吴茱萸抗瘤谱广且高效低毒，其抗肿瘤活性 的研究已取得了部分成果，然而目前临床应用仍 不多。更进一步的表型及机制研究将为临床用药 提供支持，期望将来吴茱萸作为结直肠癌辅助治 疗的天然抗癌新药应用于临床，提高患者生活质 量及生存期。

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